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1、動物細胞大規模培養技術 動物細胞大規模培養技術 動物細胞大規模培養技術是建立在貼壁培養法和 懸浮培養法基礎上，再融合了固定化細胞、流式 細胞術、填充床、生物反應器技術以及人工灌流 等技術而發展起來的。主要包括懸浮培養、微載 體培養、微囊化培養、中空纖維法等。 如今這一技術已廣泛應用于現代生物制藥的研究 和生產中。它的應用大大減少了用于疾病預防、 治療和診斷的實驗動物，為生產疫苗、細胞因子 、生物產品乃至人造組織等產品提供了強有力的 工具。 1懸浮培養技術 基本操作 (1)將動物培養材料分散成細胞懸浮液過 濾、離心、純化、漂洗后接種到有適宜 培養液的培養系統中。傳代時按比例稀 釋即可繼續培養。
2、對貼壁性細胞，最初采用在培養液中加 人一定數量的小滾瓶，增加細胞生長的 貼壁面積。此方法構造簡單，成本低， 重復性好，放大過程可依靠滾瓶數量的 增加。但產率低，勞動強度大，占空間 大。微載體系統培養貼壁細胞，一定程 度上改變了以上這些不足。微載體是直 徑60250um的微珠。 2微載體培養技術 理想的細胞支持物應該具備特征： (1)生物相容性 (2)簡便的無毒害固定化過程。 (3)良好的傳質特性。 (4)良好的機械穩定性。 (5)最大的比表面積。 (6)適合細胞生長的形狀和大小。 (7)粒徑分布均一。 (8)能高壓滅菌。 (9)可重復利用，易于清洗。 (10)能保護細胞免受機械損傷。 (11)
3、接種方便。 (12)能固定大部分細胞。 (13)適合大規模培養。 (14)易使細胞、載體與培養基分離。 (15)適合于貼壁細胞和懸浮細胞的培養。 微載體系統培養細胞的步驟是： (1)選擇合適的微載體類型 (2)浸泡水化及消毒 (3)接種 (4)培養觀察與細胞記數 (5)消化 (通常用酶消化法)。 采用膠原酶消化比胰蛋白酶-EDTA法可獲 得更完整的細胞膜和更高的細胞活性。 膠原酶專一性好，不損傷細胞膜，效果 較好。 (6)分離細胞： 對于回收率要求不高的細胞種類，分組 沉降簡單易行。 脫離微載體的培養液放入細長容器，于上清液 中分離收集細胞，400rmin，2min離心加速 微載體沉淀。 (7
4、)傳代培養： 如果進行放大培養，可在細胞脫離微載 體后，加入一些新的微載體以增大培養 體積，提高培養液的利用率，不過此法 比全部用新微載體的細胞得率要少。 盡量減少培養液中Ca2+濃度可促進微載 體之間的細胞轉移。 除了交聯葡聚糖為基質的微載體,還可采用以 下微載體： 1)纖維纖維 素為為基質質微載載體： 2)蛋白質為基質微載體：變性膠原微載體，蛋 黃色，表面特性好，易與細胞結合。 3)高分子材料為基質微載體： 4)無機玻璃基質微載體。 3 多孔載體培養 一優點 降低血清用量，增加細胞固定性。大的生長空間 ，免受機械損傷，可以提高攪拌強度和通氣量， 強化傳質。 多孔載體不僅能培養貼壁細胞，也適
5、合懸浮細胞 的固定化連續灌流培養。 多孔載體固定細胞過程簡單，對細胞無毒害和損 傷，細胞可從長滿細胞的微載體中自動轉移到未 長細胞的新載體上生長，接種方便，培養簡單， 特別適合于反應器大規模培養。 多孔載體制備的材料選擇 主要考慮材料的生物相容性、機械穩定性和熱穩 (1）生物相容性：材料對細胞必須無毒害， 對貼壁細胞有良好的黏附作用。 (2)機械穩定性：微載體在長時間攪拌狀態下 不破碎；同時滿足微載體清洗處理、回收利用 的要求。 (3)熱穩定性：在121 、蒸汽滅菌下不分解 、不破碎、不軟化。 4微囊化培養技術 微囊是一種用人造的半透膜制成的多孔微球體 ，小分子物質可以自由透過，而各種酶、輔酶
6、 、離子交換劑、活性炭及蛋白等大分子物質可 包裹在其中不能逸出，利用它們催化反應底物 。微囊化培養是借鑒固定化技術將細胞包裹在 微囊中，在培養液中懸浮培養。細胞生長在各 自的微小環境里受到一定的保護，細胞總的生 長體積有了一定的增加，而且減少了攪拌對細 胞產生的剪切力。微囊化培養為單克隆抗體、 干擾素等生產提供了有效途徑。 5 中空纖維法 中空纖維細胞培養技術是理查德克瑞 克等在1972年發明的。最初使用的空心 纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素 混合組成的可透性膜，表面有許多海綿 狀多孔結構。這樣，水分子、營養物質 和氣體可以透過，細胞也可在上面帖附 生長。 中空纖維細胞培養技術就是模擬細胞
7、在體內生 長的三維狀態，利用人工的“毛細血管”中 空纖維供給細胞生長的營養等條件。培養系統 的核心部分由3-6層這樣的空心纖維組成，培養 時將待培養細胞接種于空心纖維的外腔。 培養一段時間后，逐漸用無血培養基代替含血 培養基。此時雖然細胞不再增殖，但能正常生 活并分泌所需的代謝產物。由手這種培養方法 在分離和純化分泌物時比較方便，因而在生產 激素和單抗時經常采用。 九 動物細胞生物反應器培養 91 生物反應器的特點分析 由于動物細胞沒有細胞壁、非常脆弱、對剪切 敏感以及對體外培養環境有嚴格的要求，傳統 的微生物發酵反應器不適用于動物細胞的大量 培養，因而對動物細胞培養用反應器的設計和 過程控制
8、提出了特殊的要求。細胞培養用生物 反應器的種類越來越多，規模也越來越大，反 應器的主要結構形式仍以攪拌式、氣升式和固 定床為主。 用于動物細胞與組織培養的 生物反應器應具備的基本要求： (1)混合系統設計應能提供均勻、溫和的混合狀 態，剪切力小，保證良好的傳質效果。 (2)反應器內空間利用率高，選用合適的載體系 統和材料。 (3)能嚴格保證無菌環境。 (4)能精確地控制溫度、酸堿度、溶解氧和C02 濃度等條件。 (5)能夠方便地實現培養液的連續添加、樣品的 采樣和觀察。 92 生物反應器應用概況 采用生物反應器進行動物細胞培養是一種有效 的途徑。但是，由于動物細胞、組織的多樣性 ，使得在培養材
9、料、培養環境等方面千差萬別 ，因此，如何根據培養對象體內生存環境的特 點，開發合適的生物反應器模擬體內營養與環 境進行高效離體培養，并對培養條件、工藝等 進行優化將是重要的研究課題。 動物細胞培養用生物反應器一般有微載體 式、中空纖維式、灌注培養式、旋轉壁式等， 幾種新型的反應器類型特點介紹如下： (一)柱狀中空纖維反應器 中空纖維細胞反應器主體是由微孔中空纖維 管束制成的，纖維束由外殼包裹，因此可分為 殼體空間及管體空間兩部分，每部分各有其進 出口。一般講，細胞生長在殼體部分，新鮮培 養液從殼體部分導人，氣體在管體部分通過， 其中一部分則均勻地擴散至殼體部分。殼體部 分的細胞如是附壁性的，則
10、附著在纖維外側， 在培養結束后用胰蛋白酶消化液將其消化并沖 出：若是非附壁性的應采用微濾材料將其截留 在殼體內而讓廢培養液排出。 (二)板框式中空纖維反應器 因柱狀中空纖維反應器中營養供應和代 謝產物會存在濃度梯度，所以細胞分布 受到影響而不均勻。 人們開發出板框式中空纖維反應器。該 反應器的中心是一束中空纖維淺床，置 于兩個不銹鋼微孔濾板之間。 板框式中空纖維反應器 液營養 中空纖維板 三、中心灌流式反應器 四、灌流微載體生物反應器 (五)旋轉壁式反應器 一般由水平放置的內外兩個同心圓柱組 成。靜態的內柱由半透膜構成，使氣體 可以通過該膜進行交換。旋轉的外柱由 非通透性材料制成。 10生物反
11、應器動物細胞大規模培養 1.病毒疫苗 2.非抗體免疫調節劑 3.多肽生長因子 4.酶類 5.激素 6.腫瘤特異性抗原 7.單克隆抗體 8.病毒殺蟲劑 注意幾個問題： (一)細胞培養環境 (1)氨離子：細胞培養環境中抑制因素的積聚是 提高細胞密度的主要限制因素。(2)乳酸： (3)二氧化碳：二氧化碳積聚，對細胞產生毒性 作用或者改變細胞代謝水平。 (4)甲基乙二醛(Mc)：(5)滲透壓： (6)載體：可考慮采用多孔敬載體替代容易使 細胞受機械攪拌與噴氣損傷的常規載體。 (二)細胞死亡與凋亡 大規模細胞培養的后期，維持細胞高的活力是 個富有挑戰性的課題。最初的研究似乎表明細 胞死亡大多由于壞死，而
12、人們逐漸認識到至少 是一些細胞系在生物反應器中死亡主要原因是 細胞凋亡。 用基因工程方法將bcl2基因這種細胞凋亡 抑制基因導入細胞。bcl2基因的過量表達能 抑制細胞凋亡，提高細胞密度和目的蛋白產量 。 大規模動物細胞培養條件下，可通過“細胞靜止” 過程來降低營養成分消耗和代謝毒物產生。 (三) 培養基與細胞系 動物細胞培養基是細胞賴以生長、增殖的重 要因素。天然培養基、合成培養基后，無血清 培養基開發成為當今細胞領域的一大課題。 無血清培養基的優勢在于避免血清的批次、質 量、成分等對細胞造成的污染、毒性和不利于 產品純化等不良影響。 在生產疫苗、單抗和各種生物活性蛋白等生物 制品的應用領域
13、中，優化無血清培養基的成分 可使不同的細胞在最有利于細胞生長和表達目 的產物的環境中維持高密度培養。 (四)過程監控 測量在線氧吸收速率確定從細胞生長期 生產病毒到病毒感染期和細胞死亡后終 止感染的轉換時間；用在線葡萄糖分析 儀的測定調整灌流速度；測定氧消耗估 計營養供應率的代謝負荷；測定氧吸收 速率估測ATP的形成；測量在線氧化還 原能力作為活細胞濃度的指標等均得以 應用。 測定在線氧吸收速率并用質譜儀分析廢 氣中二氧化碳呼出率計算呼吸商。一般 來說，呼吸商應接近1.0，這就要求細胞 培養中盡量降低氧消耗和二氧化碳排出 。 用親和層析與在線取樣系統偶聯進行在線 蛋白質含量測定。另外，用在線蛋
14、白分解與 反相色譜監測重組蛋白的糖基化以了解產品 的一致性。 計數法(細胞運輸) 當前培養細胞既在國內進行寄贈、交換和購買， 也在國際交流，為此需要裝運細胞的 方法。 一種是用液氮或干冰貯存運輸，需要特殊容器 ，較麻煩，且不適于長時間運行。另一方法為充液法 ，方便當行，是當前多采用的方法。 具體方法： 選生長狀態良好的細胞，待培養近單 層后，去掉培養液充滿新培養液。液量要達培養 瓶頸部，擰緊螺帽或塞一吸塞，保留微量空氣?？諝?留量過多，運輸時大氣泡來回流動 對細胞有干擾 作用。 一般經45天運輸對細胞活力無大影響。時間過 長,細胞活力下降。 到達后，倒出大部分培養液 ，保留維持細胞生長所需的液
15、體量。置37攝氏度培養 ， 次日傳代。 十一 動物細胞體外培養舉例 腫瘤細胞的體外培養與建系過程 體外培養腫瘤細胞的歷史一定程度上代表了 動物細胞體外培養的發展歷史。 1952年，蓋爾(Gey)首先成功地建立世界上 第一個細胞系子宮頸癌細胞的細胞系，并 且使惡性腫瘤細胞的培養從間葉組織源性的細 胞轉向上皮源性細胞。 腫瘤細胞培養的發展成就主要體 現在以下幾個方面： (1)在培養的腫瘤細胞類型上，從間充質源性的細胞 轉向上皮源性細胞，再由神經外胚層源性到造血 細胞源性的發展歷程。 (2)在方法上，從原代培養到傳代培養、再到細胞系 的建立的發展過程。 (3)培養液成分上，由純血清培養基到含血清、再
16、到 無血清培養基三個階段。 (4) 生物學特性上，經歷了從細胞水平到亞細胞水平 ，再到酶和分子水平的發展。 原代培養物經首次傳代后，能在體外 繼續生長繁殖的細胞即為細胞系。然而 ，這并不意味著細胞能永久生長?？赡?過了若干代后，由于微生物污染、細胞 分化成熟、細胞不適應外界環境等因素 影響而喪失分裂能力。根據細胞分裂能 力，可分為有限細胞系與無限細胞系兩 類。一般認為，如果細胞能在體外培養 超過50代，培養時間超過一年，而且細 胞的倍增時間保持穩定時，就可以認為 建系成功。 人上皮型鼻咽癌CNE-2細胞系為例 建系過程： (1)取材 (2)原代培養 (3)建系過程 組織塊在接種1周后，上皮細胞從組織塊周圍向外迅速 遷移和生長。2周后，可見成纖維細胞生長。8周后， 上皮細胞生長開始明顯加快. 細胞在傳代三次后 貼壁生長的細胞呈現上皮狀 。2周后細胞形成群落。第4代后細胞開始呈單層生長, 命名為CNE-2。經生物學特性分析后確定細胞系建立 成功.
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