動物細胞制藥【醫療資料】

第六章 動物細胞工程制藥1 1優秀課件優秀課件一、動物細胞的形態一、動物細胞的形態 通常將離體培養的細胞分為貼壁細胞、懸浮細胞、通常將離體培養的細胞分為貼壁細胞、懸浮細胞、兼性貼壁細胞。兼性貼壁細胞。1 1、貼壁細胞：細胞的生長必須有給以貼附的支持物、貼壁細胞：細胞的生長必須有給以貼附的支持物表面，細表面，細 胞依靠自身分泌的或培養基中提供的貼附胞依靠自身分泌的或培養基中提供的貼附因子才能在該表面生長、增殖。當細胞在該表面生長因子才能在該表面生長、增殖。當細胞在該表面生長后，一般形成兩種形態：成纖維樣細胞型、上皮樣細后，一般形成兩種形態：成纖維樣細胞型、上皮樣細胞型。胞型。2 2、懸浮細胞：細胞的生長不依賴于支持物表面，可、懸浮細胞：細胞的生長不依賴于支持物表面，可在培養液中呈懸浮狀態生長。如血液中的淋巴細胞。在培養液中呈懸浮狀態生長。如血液中的淋巴細胞。3 3、兼性貼壁細胞：有些細胞的生長不嚴格地以來于、兼性貼壁細胞：有些細胞的生長不嚴格地以來于支持物，它既可以貼附于支持物表面上生長，也可以支持物，它既可以貼附于支持物表面上生長，也可以在培養基中呈懸浮狀態良好地生長。在培養基中呈懸浮狀態良好地生長。第一節第一節 動物細胞的形態與生理特點動物細胞的形態與生理特點2 2優秀課件優秀課件二、動物細胞細胞的生理特點二、動物細胞細胞的生理特點1 1、細胞的分裂周期長：一般需要、細胞的分裂周期長：一般需要12-48h12-48h，隨不同的，隨不同的種屬不同而不同。種屬不同而不同。2 2、細胞生長需貼附于基質，并有接觸抑制現象。細、細胞生長需貼附于基質，并有接觸抑制現象。細胞生長需要于基質上貼附，伸展后才能生長繁殖。胞生長需要于基質上貼附，伸展后才能生長繁殖。3 3、正常二倍體細胞的壽命是有限的。隨著年齡增大、正常二倍體細胞的壽命是有限的。隨著年齡增大而細胞的培養代數會減少。而細胞的培養代數會減少。4 4、對周圍的環境十分敏感。、對周圍的環境十分敏感。5 5、對培養基的要求高：需要、對培養基的要求高：需要1212種必需氨基酸、種必需氨基酸、8 8種以種以上的維生素、多種無機鹽和微量元素、葡萄糖、多種上的維生素、多種無機鹽和微量元素、葡萄糖、多種細胞生長因子、貼壁因子等才能生長。細胞生長因子、貼壁因子等才能生長。6 6、蛋白質的合成途徑和修飾功能與細菌不同。、蛋白質的合成途徑和修飾功能與細菌不同。3 3優秀課件優秀課件第二節第二節 生產用動物細胞的獲得生產用動物細胞的獲得一、生產用動物細胞的獲得一、生產用動物細胞的獲得 什么樣的細胞才能允許用以生產人用的藥品，這一直什么樣的細胞才能允許用以生產人用的藥品，這一直是一個引起人們爭論的熱點是一個引起人們爭論的熱點。用于生產的動物細胞有：原代細胞、已建立的二倍體用于生產的動物細胞有：原代細胞、已建立的二倍體細胞系、可無限期傳代的轉化細胞系、以及用這些細胞進行細胞系、可無限期傳代的轉化細胞系、以及用這些細胞進行融合和重組的工程細胞。融合和重組的工程細胞。1、原代細胞、原代細胞：直接取動物組織、器官，經過粉碎、消：直接取動物組織、器官，經過粉碎、消化而獲得的細胞懸液。化而獲得的細胞懸液。2、二倍體細胞系：、二倍體細胞系：原代細胞經過傳代、篩選、克隆，原代細胞經過傳代、篩選、克隆，而從多種細胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征而從多種細胞成分的組織中挑選并純化出某種具有一定特征的細胞株。的細胞株。4 4優秀課件優秀課件二倍體二倍體細細胞株仍具有正常胞株仍具有正常細細胞的特點：胞的特點：A、2n染色體核型染色體核型 B、具有明、具有明顯顯的的貼貼壁依壁依賴賴和接觸抑制和接觸抑制 C、只有有限的增殖能力、一般可、只有有限的增殖能力、一般可連續傳連續傳代培養代培養50代。代。D、無致瘤性、無致瘤性 3、轉轉化化細細胞系：胞系：是通是通過過某個某個轉轉化化過過程形成的，常常由于程形成的，常常由于染色體的斷裂染色體的斷裂變變成了異倍體，而失去了正常成了異倍體，而失去了正常細細胞的特點，胞的特點，獲獲得了無限增殖的能力。得了無限增殖的能力。5 5優秀課件優秀課件二、基因工程二、基因工程細細胞的構建和胞的構建和篩選篩選 1、真核、真核細細胞基因表達胞基因表達載載體的構建體的構建 目前一般目前一般選擇選擇的的載載體有：體有：（1）病毒）病毒載載體：體：牛痘病毒、腺病毒、反牛痘病毒、腺病毒、反轉錄轉錄病毒和桿狀病毒等。病毒和桿狀病毒等。牛痘病毒：構建多價疫苗；牛痘病毒：構建多價疫苗；腺病毒、反腺病毒、反轉錄轉錄病毒：用于基因治病毒：用于基因治療療；桿狀病毒：作桿狀病毒：作載載體用于外源基因表達。體用于外源基因表達。桿狀病毒作桿狀病毒作為載為載體的體的優優點：點：是雙是雙DNA，易于重，易于重組組；插入插入7-8個個bp的的DNA不會影響正常病毒粒子的形成；不會影響正常病毒粒子的形成；多角體蛋白多角體蛋白質質和病毒粒子的形成無直接關系，因此用外源基因更和病毒粒子的形成無直接關系，因此用外源基因更換換多多角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；角體蛋白基因，仍能形成有感染力的病毒粒子；多角體蛋白基因有多角體蛋白基因有強強啟啟動動子，子，產產生的蛋白生的蛋白質質可占全部蛋白可占全部蛋白質質的的20-30%；用用顯顯微微鏡鏡可以看到多角體，可以此可以看到多角體，可以此為標記為標記物來挑物來挑選選陽性克?。魂栃钥寺?；如果用家蠶桿狀病毒，可以在家蠶體內直接表達外源基因。如果用家蠶桿狀病毒，可以在家蠶體內直接表達外源基因。6 6優秀課件優秀課件（2）質粒載體）質粒載體 常用穿梭質粒載體：能在細菌和哺乳動物細胞內都能擴增。常用穿梭質粒載體：能在細菌和哺乳動物細胞內都能擴增。2、基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選、基因載體的導入和高效表達工程細胞株的篩選融合法融合法融合法融合法化學法化學法化學法化學法物理法物理法物理法物理法病毒法病毒法病毒法病毒法細胞融合染法細胞融合染法細胞融合染法細胞融合染法DNA-DNA-DNA-DNA-磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀法磷酸鈣沉淀法電穿孔法電穿孔法電穿孔法電穿孔法重組反轉錄病毒重組反轉錄病毒重組反轉錄病毒重組反轉錄病毒介導法介導法介導法介導法脂質體介導法脂質體介導法脂質體介導法脂質體介導法DEAE-DEAE-DEAE-DEAE-葡聚糖法葡聚糖法葡聚糖法葡聚糖法顯微注射法顯微注射法顯微注射法顯微注射法重組重組重組重組DNADNADNADNA病毒介病毒介病毒介病毒介導法導法導法導法原生質融合法原生質融合法原生質融合法原生質融合法染色體介導法染色體介導法染色體介導法染色體介導法基因槍法基因槍法基因槍法基因槍法多瘤病毒樣顆粒多瘤病毒樣顆粒多瘤病毒樣顆粒多瘤病毒樣顆粒介導法介導法介導法介導法微細胞介導法微細胞介導法微細胞介導法微細胞介導法鬼影紅細胞介導法鬼影紅細胞介導法鬼影紅細胞介導法鬼影紅細胞介導法DNADNA導入動物細胞的常用方法導入動物細胞的常用方法7 7優秀課件優秀課件高效表達工程高效表達工程細細胞株的胞株的篩選篩選：依靠構建依靠構建載載體內的體內的選擇標記選擇標記采用相采用相應應的的篩選篩選系系統統：HAT選選擇擇系系統統：篩選篩選tk+、hgprt+的的轉轉化化細細胞；胞；G418（geneticin）選擇選擇系系統統：篩選篩選neor的的轉轉化化細細胞；胞；MTX選擇選擇系系統統：篩選篩選dhfr+的的轉轉化化細細胞。胞。對選對選出的出的細細胞要胞要進進行克隆和行克隆和亞亞克隆使其克隆使其純純化化 在多數情況下要利用其在多數情況下要利用其擴擴增系增系統統，不斷增加其基因拷，不斷增加其基因拷貝貝數，數，從而從而獲獲得能高效表達的得能高效表達的穩穩定的工程定的工程細細胞株。胞株。三、常用生產用動物細胞的特性（自學）三、常用生產用動物細胞的特性（自學）8 8優秀課件優秀課件四、細胞庫的建立四、細胞庫的建立 除原代除原代細細胞外，其他的胞外，其他的細細胞株、胞株、細細胞系，無胞系，無論論是二倍體是二倍體細細胞、胞、轉轉化化細細胞、融合胞、融合細細胞胞還還是是經經重重組組的工程的工程細細胞，一旦建立胞，一旦建立后都要建立后都要建立細細胞胞庫庫加以保存。按照我國和美國加以保存。按照我國和美國FDA的的規規定，用定，用于生于生產產的工程的工程細細胞必胞必須須建立建立2個個細細胞胞庫庫：（1）原始）原始細細胞胞庫庫（master cell bank,MCB）；）；（2）生）生產產用用細細胞胞庫庫（manufacturers working cell bank,MWCB）或叫工作）或叫工作細細胞胞庫庫（working cell bank,WCB）。）。9 9優秀課件優秀課件貯藏細胞的檔案資料：貯藏細胞的檔案資料：細胞系歷史：來源、動物的年齡、性別、細胞分離方法、細胞系歷史：來源、動物的年齡、性別、細胞分離方法、所用培養材料（來源于人的還需該人的病史）所用培養材料（來源于人的還需該人的病史）細胞的特性：細胞的特性：形態、生長特性形態、生長特性增倍時間、分種批；增倍時間、分種批；種源的特性：核型、同功酶、細胞抗原、特異的標記染色體；種源的特性：核型、同功酶、細胞抗原、特異的標記染色體；用于生產用的重組細胞：載體構建的資料、基因拷貝數、表達用于生產用的重組細胞：載體構建的資料、基因拷貝數、表達產物的性質、產量及其穩定性。產物的性質、產量及其穩定性。各種有害因子的檢查結果：細菌、真菌、支原體、各種各種有害因子的檢查結果：細菌、真菌、支原體、各種病毒，包括反轉錄病毒。病毒，包括反轉錄病毒。MWCBMWCB細胞還需確定其最高使用的傳代數。細胞還需確定其最高使用的傳代數。1010優秀課件優秀課件一、動物細胞的培養條件一、動物細胞的培養條件1 1、器材的清洗和消毒、器材的清洗和消毒 （1 1）器材的清洗：）器材的清洗：用過的器材需要經過浸泡、刷洗、泡用過的器材需要經過浸泡、刷洗、泡酸、沖洗酸、沖洗4 4個步驟。用個步驟。用3%3%磷酸三鈉日夜浸泡過夜。新玻璃器材磷酸三鈉日夜浸泡過夜。新玻璃器材必須先泡酸。必須先泡酸。（2 2）器材的消毒滅菌：）器材的消毒滅菌：所有培養用的器材和液體必須進所有培養用的器材和液體必須進行嚴格的消毒滅菌處理，方法有：物理消毒行嚴格的消毒滅菌處理，方法有：物理消毒-紫外線、干熱、紫外線、干熱、濕熱、過濾；化學法濕熱、過濾；化學法-化學化學消毒劑和抗生素。第三節第三節 動物細胞的培養條件和培養基動物細胞的培養條件和培養基1111優秀課件優秀課件2 2、水質、水質 由于動物細胞對微量的有毒元素、過多的金屬離子、微生由于動物細胞對微量的有毒元素、過多的金屬離子、微生物的污染很敏感。所以細胞培養用的水必須經過特殊處理，才物的污染很敏感。所以細胞培養用的水必須經過特殊處理，才能使用。方法有：蒸餾、離子交換、電滲析、反滲透、中空纖能使用。方法有：蒸餾、離子交換、電滲析、反滲透、中空纖維過濾。維過濾。3 3、pHpH 最適最適pH7.2pH7.27.47.4，常在培養基中加入緩沖系統：，常在培養基中加入緩沖系統：Na2HPO4/NaH2PO4Na2HPO4/NaH2PO4，NaHCO3/CO2NaHCO3/CO2，Tricine-glycineTricine-glycine等。等。4 4、滲透壓、滲透壓 理想滲透壓為理想滲透壓為290-300mOsm/kg290-300mOsm/kg，一般用，一般用NaClNaCl的增減來調節。的增減來調節。每增加或減少每增加或減少1mg/ml1mg/ml，可使培養基的滲透壓增加或減少，可使培養基的滲透壓增加或減少32mOsm/kg32mOsm/kg。5 5、溫度、溫度 哺乳動物最佳溫度為哺乳動物最佳溫度為37370.50.5，昆蟲為，昆蟲為2727。6 6、空氣、空氣 必須給以足夠的氧氣，一般低于空氣中氧的飽和值的必須給以足夠的氧氣，一般低于空氣中氧的飽和值的60%60%。1212優秀課件優秀課件二、動物細胞培養基的種類和組成二、動物細胞培養基的種類和組成 動物細胞對培養基的要求較高，且隨著細胞的種屬不同動物細胞對培養基的要求較高，且隨著細胞的種屬不同而差異很大。常常需要花很多的時間和精力去對個別的細胞而差異很大。常常需要花很多的時間和精力去對個別的細胞系進行研究，以便配置適宜于這一細胞特殊需要的培養基。系進行研究，以便配置適宜于這一細胞特殊需要的培養基。用動物細胞制藥之所以成本高，培養基的復雜和昂貴是其主用動物細胞制藥之所以成本高，培養基的復雜和昂貴是其主要原因。培養基包括要原因。培養基包括1 1、天然培養基、天然培養基 指在細胞培養的早期使用，如血漿凝塊、血清、淋巴液、指在細胞培養的早期使用，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液、羊水、腹水。胚胎浸液、羊水、腹水。2 2、合成培養基、合成培養基 采用成分明確的化學試劑配成的培養基。采用成分明確的化學試劑配成的培養基。優點：成分明確，組分穩定，可大量生產供應。優點：成分明確，組分穩定，可大量生產供應。1313優秀課件優秀課件合成培養基的組成：合成培養基的組成：氨基酸類：氨基酸類：1212種必須氨基酸。它們是：精氨酸、胱氨種必須氨基酸。它們是：精氨酸、胱氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、奔丙氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、奔丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。維生素：維生素：A A、脂溶性的：、脂溶性的：VAVA、VDVD、VEVE、VKVK。B B、水溶性的：、水溶性的：VBVB族、族、VCVC等等 糖類：糖類：C C源，是能量來源。源，是能量來源。葡萄糖、谷氨酰胺。使用葡萄糖時，要加入丙酮酸鈉；有葡萄糖、谷氨酰胺。使用葡萄糖時，要加入丙酮酸鈉；有些還要加入核糖和脫氧核糖、醋酸鈉。些還要加入核糖和脫氧核糖、醋酸鈉。無機鹽：主要是保持滲透壓、緩沖無機鹽：主要是保持滲透壓、緩沖pHpH的變化，并積極的變化，并積極參與細胞代謝。一般加入參與細胞代謝。一般加入NaCl,KCl,MgSO4,CaCl2,NaH2PO4,NaCl,KCl,MgSO4,CaCl2,NaH2PO4,NaHCO3NaHCO3等。還有等。還有FeSO4,CuSO4,ZnSO4FeSO4,CuSO4,ZnSO4等等 1414優秀課件優秀課件 其其 他成分：合成核酸的前體物質，如腺苷、鳥苷、胞他成分：合成核酸的前體物質，如腺苷、鳥苷、胞苷、尿苷、胸苷。還要加入動物血清，如苷、尿苷、胸苷。還要加入動物血清，如5-10%5-10%的小牛血清，的小牛血清，作用機理不明。作用機理不明。加入動物血清可能主要是為了：加入動物血清可能主要是為了：A A 提供細胞生長增殖所需要的各種生長因子和激素；提供細胞生長增殖所需要的各種生長因子和激素；B B 提供有利于細胞貼壁所需要的貼附因子和伸展因子；提供有利于細胞貼壁所需要的貼附因子和伸展因子；C C 提供可識別金屬、激素、維生素、脂類的結合蛋白；提供可識別金屬、激素、維生素、脂類的結合蛋白；D D 提供細胞生長所必需的脂肪酸和微量元素；提供細胞生長所必需的脂肪酸和微量元素；E E 提供良好的提供良好的pHpH緩沖系統。緩沖系統。1515優秀課件優秀課件3 3、無血清培養基、無血清培養基優點：優點：A、提高細胞培養的可重復性避免了由于血清批次之間的差異；B、避免了由于血清帶來的病毒、真菌、支原體微生物等的污染；C、供應充足、穩定；D、產品易于純化；E、避免了血清中某些因素對有些細胞的毒性；F、減少了血清中某些蛋白對生物測定的干擾，便于實驗結果的分析。1616優秀課件優秀課件無血清培養基中一般需要加入：無血清培養基中一般需要加入：A、激素和生長因子；、激素和生長因子；B、結合蛋白；、結合蛋白；C、貼附和伸展因子；、貼附和伸展因子；D、其他利于細胞生長的因子和元素：如消除氧自、其他利于細胞生長的因子和元素：如消除氧自由基損害的谷胱苷肽，微量元素如硒等。由基損害的谷胱苷肽，微量元素如硒等。1717優秀課件優秀課件一、動物細胞大規模培養的方法一、動物細胞大規模培養的方法 根據培養細胞的種類分為原代細胞培培養和傳代細胞培根據培養細胞的種類分為原代細胞培培養和傳代細胞培養，也可以根據培養容器和方式的不同分為靜止培養、旋轉養，也可以根據培養容器和方式的不同分為靜止培養、旋轉培養、攪拌培養、微載體培養、中空纖維培養、固體床和流培養、攪拌培養、微載體培養、中空纖維培養、固體床和流化床培養等?；才囵B等。1 1、懸浮培養：、懸浮培養：適用于一切非貼壁細胞的培養，也適應于兼性貼壁細胞。適用于一切非貼壁細胞的培養，也適應于兼性貼壁細胞。優點：優點：操作簡便。培養條件比較均一，傳質和傳氧較好，操作簡便。培養條件比較均一，傳質和傳氧較好，容易擴大培養規模。容易擴大培養規模。缺點：缺點：由于細胞體積小，很難采取灌流培養，因此細胞由于細胞體積小，很難采取灌流培養，因此細胞密度一般比較低。密度一般比較低。第四節第四節 動物細胞培養的方式和操作方法動物細胞培養的方式和操作方法1818優秀課件優秀課件2 2、貼壁培養、貼壁培養 適用于貼壁細胞和兼性貼壁細胞。適用于貼壁細胞和兼性貼壁細胞。優點：優點：適應于細胞種類廣，因為生產中使用的大多數細適應于細胞種類廣，因為生產中使用的大多數細胞都是貼壁細胞，較易采用灌流培養，細胞密度高。胞都是貼壁細胞，較易采用灌流培養，細胞密度高。缺點：缺點：操作比較麻煩，需要合適的貼壁材料和足夠的面操作比較麻煩，需要合適的貼壁材料和足夠的面積，培養條件不易單一，傳質和傳氧較差。不便進行擴大培積，培養條件不易單一，傳質和傳氧較差。不便進行擴大培養。養。貼壁培養在傳代和擴大培養時需要用酶將細胞從基質上貼壁培養在傳代和擴大培養時需要用酶將細胞從基質上消化下來。常用的消化物有：胰酶、消化下來。常用的消化物有：胰酶、EDTAEDTA、胰酶、胰酶檸檬酸鹽、檸檬酸鹽、胰酶胰酶-EDTA-EDTA聯合使用。其他如膠原酶、鏈霉蛋白酶、木瓜酶聯合使用。其他如膠原酶、鏈霉蛋白酶、木瓜酶等。他們的作用主要是使細胞間質和一些促使細胞貼壁的蛋等。他們的作用主要是使細胞間質和一些促使細胞貼壁的蛋白因子水解，使細胞從基質分離成單個細胞。白因子水解，使細胞從基質分離成單個細胞。1919優秀課件優秀課件3 3、貼壁、貼壁懸浮培養（懸浮培養（也稱假懸浮培養）也稱假懸浮培養）是將貼壁培養和懸浮培養二者結合，優勢互補，形成更是將貼壁培養和懸浮培養二者結合，優勢互補，形成更理想、更適應于工業化生產的培養方法。理想、更適應于工業化生產的培養方法。（1 1）微載體培養）微載體培養 采用葡聚糖采用葡聚糖SephadexA50SephadexA50微顆小粒培養貼壁細胞。微顆小粒培養貼壁細胞。優點：可創造相當大的貼附面積，供細胞貼附生長增殖。優點：可創造相當大的貼附面積，供細胞貼附生長增殖。由于載體體積小，比重輕，可經輕度攪拌即可微小顆粒攜帶由于載體體積小，比重輕，可經輕度攪拌即可微小顆粒攜帶細胞自由地懸浮在培養基內，充分發揮懸浮培養的一切優點。細胞自由地懸浮在培養基內，充分發揮懸浮培養的一切優點。葡葡聚聚糖糖凝凝膠膠專專用用柱柱 2020優秀課件優秀課件理想的微載體應該具備的條件：理想的微載體應該具備的條件：A A、微載體表面性質與細胞有良好的相容性，適于細胞附著、伸、微載體表面性質與細胞有良好的相容性，適于細胞附著、伸展和增殖；展和增殖；B B、微載體的材料無毒性。對培養細胞無毒性，還要不會產生影、微載體的材料無毒性。對培養細胞無毒性，還要不會產生影響產品和人體健康的有害因子；響產品和人體健康的有害因子；C C、微載體的材料是惰性的，不與培養基成分發生化學反應，也、微載體的材料是惰性的，不與培養基成分發生化學反應，也不會吸收培養基中的營養成分；不會吸收培養基中的營養成分；D D、微載體的比重在、微載體的比重在1.0301.0301.045g/ml1.045g/ml，使載體在低速攪拌下可，使載體在低速攪拌下可以懸浮，而靜止時又可很快沉淀，便于換液和收集；以懸浮，而靜止時又可很快沉淀，便于換液和收集；E E、粒徑在、粒徑在60-250m60-250m（溶脹后）之間為好，且要盡可能均一，（溶脹后）之間為好，且要盡可能均一，差異不大于差異不大于20m20m。有利于細胞均勻分布在各微載體表面；。有利于細胞均勻分布在各微載體表面；F F、具有良好的光學透明性，適于在倒置顯微鏡下觀察細胞在載、具有良好的光學透明性，適于在倒置顯微鏡下觀察細胞在載體上的生長情況；體上的生長情況；G G、基質是軟的，避免在攪拌中載體互相摩擦而損傷細胞；、基質是軟的，避免在攪拌中載體互相摩擦而損傷細胞；H H、可耐、可耐120120高溫。便于采用高壓蒸汽滅菌；高溫。便于采用高壓蒸汽滅菌；I I、經簡單的適當處理后，可以反復多次使用；、經簡單的適當處理后，可以反復多次使用；J J、原料充分。制作簡便，廉價。、原料充分。制作簡便，廉價。2121優秀課件優秀課件目前微載體的材料有兩類：目前微載體的材料有兩類：一類在載體中加入鈦，增加比重，適用于流化床反應器。一類在載體中加入鈦，增加比重，適用于流化床反應器。一類不加鈦，比重較輕，可與固體微載體一樣，用于攪一類不加鈦，比重較輕，可與固體微載體一樣，用于攪拌罐式生物反應器或氣升式生物反應器。拌罐式生物反應器或氣升式生物反應器。（2 2）包埋和微囊培養）包埋和微囊培養 細胞不是貼附在載體表面。而是包裹在或包埋在凝膠載細胞不是貼附在載體表面。而是包裹在或包埋在凝膠載體或微囊內。如果包埋的凝膠載體較大，就稱為巨載體培養。體或微囊內。如果包埋的凝膠載體較大，就稱為巨載體培養。微囊培養是在包埋培養的基礎上衍生而來的，即將包埋微囊培養是在包埋培養的基礎上衍生而來的，即將包埋的顆粒經液化處理而成為微囊。的顆粒經液化處理而成為微囊。2222優秀課件優秀課件包埋材料的類型：包埋材料的類型：A A、人工合成的高分子聚合物：、人工合成的高分子聚合物：聚丙烯酰胺、環氧樹脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等。聚丙烯酰胺、環氧樹脂、聚氨基甲酸酯、聚乙烯醇等。B B、糖類：、糖類：纖維素、瓊脂、瓊脂糖、纖維素、瓊脂、瓊脂糖、K K卡拉膠、海藻酸鈣、脫乙?？ɡz、海藻酸鈣、脫乙酰幾丁質等。幾丁質等。C C、蛋白質：、蛋白質：膠原、明膠、纖維蛋白等。膠原、明膠、纖維蛋白等。這些材料是靠溫度的變化來變相的，如海藻酸鈣，在鈉鹽這些材料是靠溫度的變化來變相的，如海藻酸鈣，在鈉鹽時是液態。形成鈣鹽時則形成凝膠。時是液態。形成鈣鹽時則形成凝膠。凝膠的制備常常是在形成凝膠后，再用另外一種電荷相反凝膠的制備常常是在形成凝膠后，再用另外一種電荷相反的材料與之作用，使載體外形成一層聚合膜，然后再使膜內的材料與之作用，使載體外形成一層聚合膜，然后再使膜內的載體液化。的載體液化。2323優秀課件優秀課件包埋和微囊培養的優點：包埋和微囊培養的優點：A A、包埋或包裹在載體或微囊內的細胞可獲得保護，避免了、包埋或包裹在載體或微囊內的細胞可獲得保護，避免了剪切力的損害；剪切力的損害；B B、可獲得較高的細胞密度。一般在、可獲得較高的細胞密度。一般在107107108108細胞細胞/ml/ml；C C、控制微囊膜的孔徑，可使產物濃縮在微囊內，有利于下、控制微囊膜的孔徑，可使產物濃縮在微囊內，有利于下游產物的純化；游產物的純化；D D、可采用多種上午反應器進行大規模培養，如、可采用多種上午反應器進行大規模培養，如攪拌罐式生攪拌罐式生物反應器物反應器、氣升式生物反應器氣升式生物反應器。用包埋法，當顆粒直徑較大。用包埋法，當顆粒直徑較大時，可采用時，可采用固定床式生物反應器固定床式生物反應器。2424優秀課件優秀課件（3 3）結團培養）結團培養 利用貼壁細胞有結團的特點，用攪拌反應器和罐流利用貼壁細胞有結團的特點，用攪拌反應器和罐流培養的方式獲得高密度的細胞，開創了細胞結團培養的培養的方式獲得高密度的細胞，開創了細胞結團培養的新方法。新方法。其實質是用細胞本身作為基質，相互貼附后，再用其實質是用細胞本身作為基質，相互貼附后，再用懸浮的方法進行培養，也是一種貼附懸浮的方法進行培養，也是一種貼附懸浮培養。為了懸浮培養。為了加速細胞結團，往往加入一些直接較小的微粒，促使細加速細胞結團，往往加入一些直接較小的微粒，促使細胞先附著其上，再相互附著。胞先附著其上，再相互附著。優點：操作簡便，節省了用于微載體的成本。優點：操作簡便，節省了用于微載體的成本。2525優秀課件優秀課件二、動物細胞培養的操作方式二、動物細胞培養的操作方式1 1、分批式操作、分批式操作 有兩種情況：有兩種情況：一是將細胞和培養基一次性加入反應器內進行培養，使細一是將細胞和培養基一次性加入反應器內進行培養，使細胞增殖到一定密度，產物達到一定量后將培養基和細胞一并取胞增殖到一定密度，產物達到一定量后將培養基和細胞一并取出。出。另一種方式是先將細胞和培養基加入反應器，待細胞生長另一種方式是先將細胞和培養基加入反應器，待細胞生長至一定密度后，向反應器內加入誘導劑或病毒，經過一段時間至一定密度后，向反應器內加入誘導劑或病毒，經過一段時間作用后，取出反應物。作用后，取出反應物。2 2、半連續式操作、半連續式操作 將細胞和培養基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形將細胞和培養基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形成過程中，每間隔一段時間，取出部分培養物，然后補充同樣成過程中，每間隔一段時間，取出部分培養物，然后補充同樣數量的新鮮培養基，或另加新鮮載體，繼續培養。該方法被廣數量的新鮮培養基，或另加新鮮載體，繼續培養。該方法被廣泛采用，優點是：泛采用，優點是：操作簡單、生產效率高，可長期進行生產，反復收獲產品，操作簡單、生產效率高，可長期進行生產，反復收獲產品，能使細胞密度和產品產量一直保持在較高的水平能使細胞密度和產品產量一直保持在較高的水平 2626優秀課件優秀課件3 3、灌流式操作、灌流式操作 將細胞和培養基一起加入反應器后，在細胞增長將細胞和培養基一起加入反應器后，在細胞增長和產物形成過程中，不斷將條件培養基取出，同時不和產物形成過程中，不斷將條件培養基取出，同時不斷補充新鮮培養基。它與連續式操作不同之處是取出斷補充新鮮培養基。它與連續式操作不同之處是取出部分條件培養基時，絕大部分細胞仍保留在反應器內，部分條件培養基時，絕大部分細胞仍保留在反應器內，而連續式培養則同時也取出了部分細胞。而連續式培養則同時也取出了部分細胞。優點：優點：A、細胞可處在較穩定的良好環境中，培養條件較好，、細胞可處在較穩定的良好環境中，培養條件較好，有害代謝廢物濃度低；有害代謝廢物濃度低；B、可極大地提高細胞密度，使產量大大提高；、可極大地提高細胞密度，使產量大大提高；C、產品在罐內停留時間縮短可及時收留在低溫下保、產品在罐內停留時間縮短可及時收留在低溫下保存，有利于產品質量的提高；存，有利于產品質量的提高；D、培養基的比消耗率較低，且產量質量提高，生產、培養基的比消耗率較低，且產量質量提高，生產成本明顯降低。成本明顯降低。2727優秀課件優秀課件一、理想的動物細胞反應器必須具備的要求一、理想的動物細胞反應器必須具備的要求1 1、制造生物反應器所采用的一切材料，尤其是與培養基、細、制造生物反應器所采用的一切材料，尤其是與培養基、細胞直接接觸的材料必須無毒性；胞直接接觸的材料必須無毒性；2 2、生物反應器的結構必須使之具有良好的傳熱、傳質和混合、生物反應器的結構必須使之具有良好的傳熱、傳質和混合性能；性能；3 3、密封性能良好，可避免一切外來微生物的污染；、密封性能良好，可避免一切外來微生物的污染；4 4、對培養環境中多種物理化學參數能自動檢測和調控；、對培養環境中多種物理化學參數能自動檢測和調控；5 5、可長期連續運轉；、可長期連續運轉；6 6、容器內表面要求光滑，無死角，以減少細胞或微生物的沉、容器內表面要求光滑，無死角，以減少細胞或微生物的沉積；積；7 7、拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維、拆裝、連接和清潔方便，能耐高壓蒸汽消毒，便于操作維修；修；8 8、設備成本低、設備成本低 。第五節第五節 動物細胞生物反應器及其檢測控制系統動物細胞生物反應器及其檢測控制系統2828優秀課件優秀課件二、動物細胞生物反應器的類型二、動物細胞生物反應器的類型1 1、攪拌罐式反應器：是借鑒細菌發酵罐改造而來，是最早的動、攪拌罐式反應器：是借鑒細菌發酵罐改造而來，是最早的動物細胞生物反應器。特點：能供氧、攪拌速度慢、采用無氣泡系物細胞生物反應器。特點：能供氧、攪拌速度慢、采用無氣泡系統、配置有進出料系統。統、配置有進出料系統。2 2、氣升式生物反應器、氣升式生物反應器 特點：氣體從罐底的導流管進入，使液體形成循環流。具有特點：氣體從罐底的導流管進入，使液體形成循環流。具有剪切力小、混合均勻、氧和營養的傳遞好、利于密封等優點。剪切力小、混合均勻、氧和營養的傳遞好、利于密封等優點。3 3、中空纖維式生物反應器、中空纖維式生物反應器 該反應器由數百至數千根中空纖維集束組成。材料為聚砜或該反應器由數百至數千根中空纖維集束組成。材料為聚砜或丙烯共聚物。丙烯共聚物。4 4、透析袋或透析膜式生物反應器、透析袋或透析膜式生物反應器 主要是能夠將分子量小而對細胞生長和產物的產生有抑制作主要是能夠將分子量小而對細胞生長和產物的產生有抑制作用的乳酸、氨等透析或濾掉。用的乳酸、氨等透析或濾掉。5 5、固定床或流化床式生物反應器、固定床或流化床式生物反應器 特點：結構簡單，添裝材料是對細胞無毒、又有利于細胞貼特點：結構簡單，添裝材料是對細胞無毒、又有利于細胞貼附的材料?，F用于大量生產疫苗和基因工程產品。附的材料。現用于大量生產疫苗和基因工程產品。2929優秀課件優秀課件一、改進表達載體，提高表達水平和產量一、改進表達載體，提高表達水平和產量1 1、采用雜交瘤技術，提高細胞表達量。、采用雜交瘤技術，提高細胞表達量。2 2、采用更強的啟動子和增強子。、采用更強的啟動子和增強子。3 3、更好地利用擴增系統或尋找高表達位點。、更好地利用擴增系統或尋找高表達位點。4 4、采用和改造更好的宿主細胞。、采用和改造更好的宿主細胞。二、利用代謝工程，改進培養工藝，降低生產成本二、利用代謝工程，改進培養工藝，降低生產成本1 1、采用代謝工程改造工程細胞、采用代謝工程改造工程細胞 代謝工程：采用基因工程手段，使工程細胞增加或減少代謝工程：采用基因工程手段，使工程細胞增加或減少某種酶，以改造其代謝能力和途徑，使其降低對某種營養物某種酶，以改造其代謝能力和途徑，使其降低對某種營養物質的需要，減少某些代謝產物的產生和危害，以及控制工程質的需要，減少某些代謝產物的產生和危害，以及控制工程細胞的增殖速度和制造產品的能力。細胞的增殖速度和制造產品的能力。第六節第六節 動物細胞制藥的前景與展望動物細胞制藥的前景與展望3030優秀課件優秀課件2 2、改進培養基的配方，應用廉價培養基材料；改變細胞代謝、改進培養基的配方，應用廉價培養基材料；改變細胞代謝途徑，以降低培養基的成本。途徑，以降低培養基的成本。3 3、改進產品質量：解決好代謝產物糖基化問題。糖基化的有、改進產品質量：解決好代謝產物糖基化問題。糖基化的有無和正確與否，將直接關系到藥物的藥效、藥代動力學、抗無和正確與否，將直接關系到藥物的藥效、藥代動力學、抗原性等，使產品的側鏈糖基的種類與天然產品相同或接近。原性等，使產品的側鏈糖基的種類與天然產品相同或接近。4 4、改進生產工藝和生產設備，使細胞的密度進一步提高，提、改進生產工藝和生產設備，使細胞的密度進一步提高，提高生產效率。高生產效率。三、抑制細胞凋亡，延長培養周期三、抑制細胞凋亡，延長培養周期1 1、通過培養基和氧的優化供應防止營養和氧的缺乏；、通過培養基和氧的優化供應防止營養和氧的缺乏；2 2、采用化學添加劑（如抗氧化劑）阻斷細胞凋亡過程；、采用化學添加劑（如抗氧化劑）阻斷細胞凋亡過程；3 3、采用抗細胞凋亡基因改造工程細胞。、采用抗細胞凋亡基因改造工程細胞。3131優秀課件優秀課件四、采用糖基化過程，提高產品質量四、采用糖基化過程，提高產品質量 決定糖鏈類型的主要因素：決定糖鏈類型的主要因素：1 1、合成肽鏈的不同；、合成肽鏈的不同；2 2、細胞內糖基化酶的不同；、細胞內糖基化酶的不同；3 3、細胞培養環境的影響。、細胞培養環境的影響。目標：生產的蛋白質糖基化形式與人類的一致。目標：生產的蛋白質糖基化形式與人類的一致。3232優秀課件優秀課件二、轉基因動物的研究二、轉基因動物的研究 應用轉基因動物來生產蛋白藥物，轉基因動應用轉基因動物來生產蛋白藥物，轉基因動物存在的問題：一是轉基因方法還不十分成熟，物存在的問題：一是轉基因方法還不十分成熟，二是基因產品對動物健康產生影響，三是產品對二是基因產品對動物健康產生影響，三是產品對人體健康產生影響，主要是產品攜帶有害病毒影人體健康產生影響，主要是產品攜帶有害病毒影響產品的安全。響產品的安全。三、組織工程的研究三、組織工程的研究 直接將培養的細胞作為一種治療手段用于臨直接將培養的細胞作為一種治療手段用于臨床，或用培養的細胞進一步加工成一種組織，如床，或用培養的細胞進一步加工成一種組織，如人造皮膚、人造肝臟、胰腺、血管、骨等人造器人造皮膚、人造肝臟、胰腺、血管、骨等人造器官。官。3333優秀課件優秀課件