免疫標記技術【醫療資料】

Immunolabeling techniqueImmunolabeling technique1優秀課件 第一節第一節 免疫標記技術的基本概念免疫標記技術的基本概念一、免疫標記與標記免疫的概念二、常用的免疫標記物質2優秀課件 免疫標記與免疫標記與標記免疫標記免疫免疫標記技術免疫標記技術：標記物與免疫活性物質的聯接技術標記免疫技術標記免疫技術：以標記免疫物質檢測相應靶物質的技術3優秀課件免疫標記技術免疫標記技術=抗原抗體反應抗原抗體反應抗原抗體反應抗原抗體反應示蹤物標記示蹤物標記靈敏性靈敏性靈敏性靈敏性特異性特異性特異性特異性免疫標記技術的主要特點：免疫標記技術的主要特點：高特異性高特異性、高靈敏性高靈敏性免疫技術免疫技術+標記技術標記技術酶酶酶酶熒光素熒光素熒光素熒光素同位素同位素同位素同位素其它其它其它其它4優秀課件常用的免疫標記物質常用的免疫標記物質類別 標記物 用途熒光素 FITC、RB200、TRITC 免疫組化 鑭系元素螯合物 免疫分析測定放射性核素 3H、14C、32P、57Gr 免疫分析測定 125I、131I酶 HRP、AP 免疫組化 免疫分析測定化學發光物 Luminol、lucigenin 免疫分析測定金屬顆粒 膠體金、鐵蛋白 免疫組化 免疫分析測定 5優秀課件 第二節第二節 標記免疫技術的分類標記免疫技術的分類一、按指示標記物質劃分的類型二、按測定方式劃分的類型三、按測定用途劃分的類型6優秀課件1、酶免疫技術2、熒光免疫技術3、放射免疫技術4、金免疫技術按指示標記物質劃分的類型按指示標記物質劃分的類型7優秀課件1、均相型（homogenous）2、非均相型（heterogeneous）按測定方式劃分的類型按測定方式劃分的類型8優秀課件均相型（均相型（homogenous）非均相型非均相型（heterogeneous）9優秀課件1、免疫測定技術2、免疫組化技術按測定用途劃分的類型按測定用途劃分的類型10優秀課件 第三節第三節 酶標記技術酶標記技術一、常用標記方法二、標記免疫物的分離與鑒定11優秀課件常用標記方法常用標記方法1、常用酶 辣根過氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）2、標記方法 戊二醛交聯法 過碘酸鹽氧化法12優秀課件戊二醛交聯法戊二醛交聯法(一步法）一步法）抗體-NH2 +COH-（CH2）3-COH +NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-抗體酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶13優秀課件戊二醛交聯法（二步法）戊二醛交聯法（二步法）COH-（CH2）3-COH +NH2-酶抗體-NH2 +CHO-（CH2）3-CH=NH2-酶抗體-NH2 =CH-（CH2）3-CH=NH2-酶14優秀課件過碘酸鹽氧化法過碘酸鹽氧化法OOOOOONaIO4OOOHOOOHOH+NH2抗體OOONN抗體抗體H2ON抗體NaBH4Schiff堿酶-五炭糖環15優秀課件標記免疫物的分離與鑒定標記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離酶 方法：鹽析、柱層析2、鑒定 抗體活性 酶活性 標記物純度16優秀課件 酶聯免疫吸附實驗酶聯免疫吸附實驗enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）17優秀課件ELISAELISA基本的實驗過程基本的實驗過程18優秀課件ELISA技術的原理與方法技術的原理與方法間接法 夾心法 競爭法19優秀課件間接法間接法20優秀課件夾心法夾心法21優秀課件競爭法競爭法22優秀課件 第四節第四節 熒光標記技術熒光標記技術一、常用標記方法二、標記免疫物的分離與純化23優秀課件常用標記方法常用標記方法1、熒光素的概念2、生物標記熒光素的要求3、常用熒光素標記原理與方法 24優秀課件生物標記熒光素的要求生物標記熒光素的要求1、具有與蛋白質共價結合的能力2、熒光效率高3、能與背景物質形成鮮明對比4、不影響蛋白質的生物、免疫活性5、標記方法安全、簡便6、標記物穩定，易保存25優秀課件熒光抗體技術的原理與方法熒光抗體技術的原理與方法直接法間接法補體法雙標記法 26優秀課件直接法間接法補體法雙標記法27優秀課件標記免疫物的分離與鑒定標記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離熒光素 方法：柱層析2、鑒定 抗體活性 標記物結合度 F/P比值的應用意義28優秀課件 第五節第五節 放射性核素標記技術放射性核素標記技術一、常用標記方法二、標記免疫物的分離與純化29優秀課件直接法（氯胺直接法（氯胺T T法）法）OH-NHCHONH-CH2OH-NHCHONH-CH2Na125I 4。C125I氯胺T30優秀課件間接法（連接法）間接法（連接法）CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2CH2OHOH-C-C-O-N-C-CH2H O O=C-C-CH2+Na125I氯胺T125INSHPP31優秀課件結合相游離相放射免疫分析法的原理與方法放射免疫分析法的原理與方法32優秀課件常用標記方法常用標記方法1、常用放射性核素2、125I 的標記方法 直接法（氯胺T法）間接法（連接法）33優秀課件標記免疫物的分離與鑒定標記免疫物的分離與鑒定1、分離 目的：去除游離放射性核素 方法：柱層析2、鑒定 游離放射性核素含量 免疫活性 比放射性（mCi/mg）應用意義34優秀課件第六節第六節 膠體金標記免疫技術膠體金標記免疫技術(金標法金標法)膠體金是由氯化金與還原劑反應形成的一種膠體顆粒，具有吸附蛋白質的特性(可以標記Ag或Ab)；膠體金顆粒具有呈色性，中等大小的膠體金顆粒呈現酒紅色。膠體金標記免疫技術是將金顆粒光學檢測的靈敏性和抗原抗體反應的特異性相結合。35優秀課件膠體金免疫法與膠體金免疫法與RIA、ELISA等方等方法相比法相比,有許多優點：有許多優點：1.它不需ELISA法中所要求的作用的底物和顯色劑，使操作更簡便;2.膠體金法無污染，不含危害操作者即污染環境;3.膠體金標抗體在凍干狀態下室溫儲存較穩定,有效期長;4.靈敏度高。36優秀課件免疫標記技術的比較免疫標記技術的比較 FIA ELISA RIA敏感性 較低 高 高特異性 高 高 高重復性 差 好 好檢測對象 Ag/Ab Ag/Ab Ag37優秀課件