血細胞染色方法的探討分析研究生物技術專業

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1、 摘要 目的：本論文用不同的染色方法對血涂片染色，觀察血細胞的形態，比較對血細胞的不同辨別結果。方法：通過Giemsa染色法、Wright染色法和 Giemsa-Wright混合液染色3種染色方法對血涂片進行染色和血細胞的形態學觀察。結果：在染色時間上Giemsa 染液染色時間最長、Wright 染液染色時間最短、Giemsa-Wright 混合液染色時間介于兩者之間，Giemsa 染液的細胞核染色效果好，細胞質界限清晰，但細胞質中的顆粒染色效果較差；Wright 染液染對細胞核和細胞質中的顆粒染色效果較好，細胞質的界限不淸；Giemsa-Wright 混合染色具細胞核和細胞質中的顆粒染

2、色效果較好，細胞界限清晰。結論：Giemsa染色法、Wright染色法和 Giemsa-Wright 混合染色三種染色方法均能有效的協助甄別血細胞，Giemsa-Wright 混合染色方法相較于前兩種方法染色效果更為明顯，值得廣泛應用。 關鍵詞：血細胞；血涂片；Giemsa染色法；Wright染色法；Giemsa-Wright 混合染色法；細胞形態學 ABSTRACT Objective: In this paper, different staining methods were used to stain the blood smears

3、, observe the morphology of blood cells, and compare the different results of blood cells. Methods: The blood smears were stained by Giemsa staining, Wright staining and Giemsa-Wright staining. The morphological changes were observed. Results:The Giemsa-Wright mixture had the shortest staining time,

4、 the Giemsa-Wright mixture had the shortest dyeing time, the Giemsa-Wright mixture had the same staining time, and the cytoplasmic boundaries were clear, but the cytoplasm was clear The staining effect of Wright dye on the nucleus and cytoplasm was better, and the cytoplasmic boundaries were not cle

5、ar. Giemsa-Wright mixed staining had better staining effect on the nuclei and cytoplasm, and the cell boundaries were clear . Conclusion: Giemsa staining method, Wright staining method and Giemsa-Wright hybrid staining method can effectively help to identify blood cells. Giemsa-Wright mixed staining

6、 method is more obvious than the first two methods, and it is worthy to be widely used. Key Words: blood cells; blood smear; Giemsa staining; Wright staining; Giemsa-Wright mixed staining; cell morphology 目錄 摘要 I ABSTRACT II 第一章 緒論 1 第二章 材料與方法 2 2.1 實驗材料 2 2.1.1 主要儀器 2 2.1.2 試劑及藥品 2 2.1.

7、3主要試劑的配制 2 2.2 實驗方法 4 2.2.1 血涂片的制作 4 2.2.2 Giemsa 染色 4 2.2.3 Wright 染色 4 2.2.4 Giemsa-Wright 染色 4 2.2.5 注意事項 5 第三章 結 果 5 3.1 Giemsa 染色 5 3.2 Wright 染色 6 3.3 Giemsa-Wright 染色 6 第四章 探究不同條件下三種染色方法的效果 6 4.1 不同染色條件下Giemsa的染色效果 6 4.2 不同條件下 Wright染液的染色效果 7 4.3 不同條件下Giemsa-Wright混合染液染色效果 7 第

8、五章 討 論 7 4.1 Giemsa 氏染色法 7 4.2 Wright 氏染色法 8 4.3 Wright-Giemsa 混合法 8 附 圖 表 11 參考文獻 14 REFERENCES 15 致謝 18 第一章 緒論 血細胞存在于血液中,隨著血液的流動遍及全身。以哺乳動物來說，扮演了主要的免疫的角色的是血細胞中的白細胞【1】。白細胞能在病菌侵入人體時，穿過毛細血管壁，聚集到病菌入侵部位，將病菌包圍并吞噬。要從根本上解決疾病的危害，必須對不同種類生物的免疫機制進行深入研究，因此對血細胞的研究在生物免疫反應科研進程中起著至關重要的作用，但目前對很多類生物的血細胞

9、的分類及其功能研究仍然不是很充分，不同研究者之間尚未達成共識，這對地球上生物免疫學的研究造成了很大的障礙【2-4】。 近百年來國內外的學者應用光鏡、電鏡、組織化學、免疫學單克隆抗體、物理染色等技術對血細胞形態、結構進行觀察分類，觀察細胞內各種組分的分子組成及功能。尤其是血細胞染色法簡便易于操作，對于動物的生理和病理研究具有十分重要的意義,特別是對于與血液及細胞免疫相關的疾病的鑒定意義重大，血細胞染色觀察至今仍是最基本的診斷手段。 血細胞涂片染色效果的好壞,對于細胞的形態觀察和分類具有決定性的意義【5-7】。通過研究血細胞染色方法，來進一步分析血細胞對免疫反應的作用，對于解決人類和其他生物的疾

10、病具有重大的意義。 本文就三種血細胞染色方法進行探討，觀察三種方法下血細胞的不同染色效果以及各自對細胞分類影響。 第二章 材料與方法 2.1實驗材料 2.1.1 主要儀器 培養皿 保溫箱 分析檢測的儀器 滅菌箱 臺式離心機 血細胞計數板 顯微鏡 2.1.2 試劑及藥品 姬姆氏色素(BS) 鐘樓區北港海拓實驗儀器經營部 瑞氏色素(BS) 上海展云化工有限

11、公司 磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醛 連云港市德邦精細化工有限公司 乙醇、二甲苯、鹽酸、氫氧化鈉 連云港市德邦精細化工有限公司 2.1.3主要試劑的配制 （1） Giemsa染液的配制 取姬姆氏色素(BS) 0.5g放入研缽中，先加入少量甘油，研磨至無顆粒為止，然后再將全部甘油倒入，放56℃溫箱中2小時后，加入甲醇33ml，將配制好的染液密封保存棕色瓶內(最好于0~4℃保存)【8-11】。 （2） Wright 染液的配制 將瑞氏色素(BS) 0.1g放入清潔干燥研缽中，先加少量甲醇，

12、充分研磨使染料溶解，將已溶解的染料倒入棕色試劑瓶中，未溶解的再加少量甲醇研磨，直至染料完全溶解，60ml的甲醇全部用完為止。染液配好后放于室溫下，一周后即可使用。新配制染液效果較差，放置時間延長，染色效果越好。久置應密封，以免甲醇揮發或氧化成甲酸。染液中也可加中性甘油2～3ml，除可防止甲醇過早揮發外，也可使細胞著色清晰。 （3） Giemsa-Wright染液的配制 取 姬姆氏色素(BS)、瑞氏色素(BS)各1g，放入研缽，慢慢把10ml甘油倒入研缽內，仔細研磨至完全溶解，然后加入500ml甲醛，將配制好的染液密封保存棕色瓶內。 （4） Sorensen緩沖液的配制 稱

13、取磷酸二氫鉀（無水）1 g，磷酸氫二鈉（無水）1 g；加蒸餾水至1000 ml使其溶解。配好后磷酸鹽緩沖溶液應校正PH值，其范圍在PH6.4～7.0即可，后塞緊瓶口備用。 2.2 實驗方法 2.2.1 血涂片的制作 用蘸有體積分數為75%的酒精的脫脂棉,對將要取血的部位（如指尖）進行消毒；用已消毒的針尖刺破指尖的皮膚；擠出一滴血,滴在已消毒的載玻片上；?另取一片載玻片作推片,將推片自血滴左側向右移動；當血滴均勻地附著在兩片之間后,再將推片向左平穩地推移（兩片成30~45度夾角）；?推出均勻的血膜【12】。 2.2.2 Giemsa 染色 染色方法: 待血涂片干燥后

14、，將涂片放入濕盒，加 4 ～ 6 滴 Giemsa 染色液覆蓋血膜，染色 35 分鐘，然后加 8 ～ 12 滴Sorensen緩沖液染色 25 分鐘，自來水沖洗，晾干，封藏。 2.2.3 Wright 染色 染色方法: 將血涂片放入濕盒，加入數滴 Wright 染色液，使染液將涂片完全覆蓋，染色2 分鐘，然后加等量的Sorensen緩沖液 ，靜止 3 分鐘，自來水沖洗，晾干，封藏。 2.2.4 Giemsa-Wright 染色 染色方法: 待血膜干燥后，滴加 Giemsa-Wright染色液 4 ～ 5 滴，染色 3 分鐘，然后加Sorensen緩沖液 2 ～

15、3 倍，混勻，染色 15分鐘，自來水沖洗，晾干，封藏。 2.2.5 注意事項 （1）PH對細胞染色有影響。由于細胞中各種蛋白均為兩性電解質，所帶電荷隨溶液PH而定。對某一蛋白質而言，如環境PH

16、水沖去，以防染料沉淀在血膜上。 （5） 如血膜上有染料顆粒沉積，可加少許甲醇溶解，但需立即用水沖洗掉甲醇，以免脫色。 （6）染色過淡，可以復染。復染時應先加緩沖液，創造良好的染色環境，而后加染液，或加染液與緩沖液的混合液，不可先加染液。 （7） 染色過深可用水沖洗或浸泡水中一定時間，也可用甲醇脫色。 （8）染色偏酸或偏堿時，均應更換緩沖液再重染。 第三章 結 果 3.1 Giemsa 染色 顯微鏡下觀察血涂片，紅細胞呈粉紅色，在厚薄均勻處，略有碟狀感。白細胞漿中顆粒清楚，并顯示出各種細胞特有的色彩。細胞核染紫紅色或藍紫

17、色，核染色質結構清楚。粒細胞的細胞核和細胞本身的界限分明 ( 圖版 : 圖G1 ～ 圖G4 ) ，但細胞質中的顆粒染色較差，分辨的不是十分清晰【13-16】。 3.2 Wright 染色 顯微鏡下觀察血涂片，血膜外觀染成淡紫紅色。顯微鏡下，紅細胞呈粉紅色，在厚薄均勻處，略有碟狀感。白細胞漿中顆粒清楚，并顯示出各種細胞特有的色彩。細胞核染紫紅色，核染色質結構清楚。該 結 果 與Giemsa 滴染相似，粒細胞細胞質中的顆粒著色較好，但細胞核不如 Giemsa 滴染時清晰( 圖版 : 圖W1～ 圖W4) ，細胞質界限不是十分清晰，有時看不到細胞質界限【17】。 3.3 Giemsa

18、-Wright 染色 顯微鏡下觀察血涂片，紅細胞呈桔紅色 ；中性粒細胞核藍色 ，顆粒呈紫色 ；嗜酸性粒細胞核呈藍色 ，顆粒呈紅色或桔紅色；嗜堿性粒細胞核呈暗藍紫色,，顆粒呈深藍黑色；淋巴細胞核深藍紫色,，胞質天藍色；單核細胞核藍紫色，胞質灰藍色。其中以嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞顆粒最清晰。Giemsa-Wright 滴染時，染色時間介于 Giemsa 和 Wright 染色之間，其結果是粒細胞 的細胞核和細胞質分均著色較好，細胞質中的顆粒成分和細胞界限均清洗可見 ( 圖版：圖G-W1～圖G-W4)。 第四章 探究不同條件下三種染色方法的效果 4.1不同染色條件下Giemsa的染

19、色效果 采用Giemsa染液,在不同染液用量、染色時間、分色方式和分色時間等條件下,對血涂片進行染色。顯微鏡下觀察血細胞的染色效果，部分結果見表1。在實驗進程中我們還對比了不同溫度條件下姬姆薩染液的結果,發現38℃條件下的染色效果比25℃條件下的效果好。38℃溫度條件下尤以下四種情況染色效果為佳,可以對血細胞的種類進行明確區分:①染色20min,分色1min；②染色10min，水洗分色；?珍適量染料染20～30min；④染色20～30min，50%乙醇分色5s。 4.2不同條件下 Wright染液的染色效果 采用 Wright染液:緩沖液=1:2的比例，改變染色時間、分色

20、方式和分色時間等染色條件,對血涂片進行染色,顯微鏡下觀察染色效果,部分結果見表2。由表2可知,瑞氏染液在25℃染色15min后,用95%或者50%的乙醇分色5s的染色條件下可以取得較好的染色效果。 4.3不同條件下Giemsa-Wright混合染液染色效果 比較采用Giemsa-Wright混合染液,通過改變染色時間、染色溫度,分色方式和分色時間、染液用量和濃度等染色條件,對血涂片進行染色。顯微鏡下觀察染色效果。部分結果見表3，由表3可知,25℃下混合染液在以下三種染色條件下可以取得較好的染色效果:①混合染液:緩沖液=l:2，25℃染10min水洗；②適量混合染液25℃染10min

21、,水洗；③25℃染15min，50%乙醇洗5s。 第五章 討 論 血細胞形態結構的觀察 ,是研究動物免疫的一個重要環節,血涂片染色的質量,直接影響到觀察結果。正常情況下 ,染色時間與染液濃度、室溫及細胞多少有密切關系, 即染液愈濃 , 室溫愈低 ,細胞愈多 ,則所需的染色時間愈長。因此要想染出結果比較理想的血涂片, 必須根據具體情況靈活掌握, 必要時沖洗前在低倍鏡下觀察有核細胞是否染色清楚,核著色是否分明【18】。 4.1 Giemsa 氏染色法 Giemsa 氏染色法優點是從對血涂片的染色結果可以看到，細胞核染色清晰，

22、細胞界限分明。由于 Giemsa 染液在染色過程中不會揮發，血涂片在染色過程中不易污染，染色過程易控制，染色效果對染液 pH 值要求高，對該血細胞的染色以 pH6.8染色效果最好；缺點是從結果可以看到，Giemsa 氏染色法對粒細胞細胞質中的顆粒成分的染色不是十分清晰，染色時間長。由于本實驗也使用了以蒸餾水沖洗后，短暫地浸入加進幾滴的碳酸鋰的蒸餾水中，以辨別染成紅色的結構; 而以用水沖洗后，短暫地浸入加進幾滴稀鹽酸的蒸餾水中，以辨別染成藍色的結構，但 Giemsa 氏染色法對粒細胞中的顆粒顯示仍然不是十分理想，故在血涂片染色時不建議使用。 4.2 Wright 氏染色法 Wr

23、ight 氏染色法優點是從對血涂片的染色結果優點是從對血涂片的染色結果可以看到，對粒細胞質中的顆粒成分染色十分清晰，染色時間短，結果出現的快；缺點是對細胞核的染色不如 Giemsa 氏染色法染的清晰，細胞界限不清，再之，Wright 染色液中由于沒有加入甘油，則易使染液揮發而造成血涂片的污染，從而使其染色過程不易掌握。由于該方法所使用的試劑配制簡單，染色時間短等特點，可以用于血細胞的染色和血細胞類型的辨別，尤其可以在實驗教學中，用于血細胞的辨別。 4.3 Wright-Giemsa 混合法 Wright-Giemsa 混合法優點是從血涂片的染色結果可以看到，Wright-Gi

24、emsa 混合法不僅對粒細胞的細胞核和細胞質中的顆粒成分著色清晰，同時細胞界限也較為分明，該方法起到了2 種染液互補的作用； 缺點，染液易揮發和變性快，易污染，為了避免該缺點，使用 Wright-Giemsa 染液時，第一，要在濕盒中進行; 第二，在滴染時要多加入幾滴染液； 第三，在血涂片染色結束后，要盡快用水沖洗，用自來水沖洗要比用蒸餾水或緩沖液沖洗更方便和徹底，可通過調節自來水的水壓，及時沖去結合尚未牢固的染料沉渣，以減少污染。該法不僅可以廣泛用于血細胞的染色和血細胞的類型識別，同時也可以在實驗教學中廣泛使用，是廣泛研究血細胞的一個較好的染色方法。 筆者認為Wright-Giem

25、sa混合染色法之所以染色效果較好 ,主要是因為Wright染色法對粒細胞的特異性顆粒著色性比姬姆薩染色法好, 但核的染色卻不如姬姆薩染色法；而Giemsa薩染色法對細胞核著色較好 ,結構顯示較清晰,而胞漿和特異性顆粒則染色較差。因此,采用Wright-Giemsa混合染色法可兼取二者之長,使血涂片染色效果更為理想。 應注意的是玻片必須清潔, 配制染料需用優質甲醇,稀釋染液需用緩沖液, 沖洗需用中性流水 ,才能保證各種細胞著色正常。 第六章 結 論 通過實驗和觀察，我們發現Giemsa 染液染色時間較長，對細胞核染色效果較好，

26、細胞質界限清晰，但對細胞質中的顆粒染色較差； Wright 染液染色時間較短，對細胞核和細胞質中的顆粒染色效果較好，但細胞質的界限不淸; Giemsa-Wright 混合染色具備了兩種染液的優點，時間介于兩者之間，細胞核和細胞質中的顆粒染色效果較好，細胞界限清晰，該法可用于血細胞中的廣泛研究【19-20】。通過實驗還發現對于血細胞的著色,染液的濃度對染色結果影響很大。染色時應先滴加緩沖液,再滴加染液,以避免細胞染色過深。對于染色后的分色,如果用95%的乙醇分色,其脫色效果過強,一般不推薦使用；用50%乙醇分色,其脫色效果適中,可供調節的范圍較大,是首選分色劑；而用緩沖液分色的效果不很理想,細胞

27、類型區分不夠鮮明。 附 圖 表 圖版：血細胞染色方法的比較 表1 38℃不同染色條件下姬姆薩染液部分染色結果 染色程序 顆粒著色 細胞核著色 細胞質著色 備注 染色30min,95%乙醇浸泡5s 紫紅/紅 淡藍/淡藍紫 無色 部分細胞顆粒染色過度,將核掩蓋 染色30min,50%乙醇浸泡5s 紅 藍包藍紫色 微紅 三種細胞類型可以較好區分 染色2min,50%乙醇沖洗分色 紅包淡紫

28、 天藍色/藍色 微藍/無色 三種細胞類型可以較好區分 染色20min,50%乙醇浸泡分色 5-9s 紅包深紅 紫紅 微藍 部分細胞顆粒染色過度,將核掩蓋 染色20min,PBS分色1min 紅 紫紅/紅 淡紅 脫色較好 染色20min,PBS分色2min 紫紅/紅 紫/紅 淡紅 脫色較好 適量染料,染20min,水洗 紅/紅黑 天藍/紫紅 淡紅 部分細胞顆粒染色過度 染色10min,水洗 紅/紅黑 天藍/藍紫 微藍 三種細胞類型可以較好區分

29、 表2 25℃不同染色條件下瑞氏染液部分染色結果 染色程序 顆粒著色 細胞核著色 細胞質著色 備注 染色10min,水洗 紅或紅黑 深紅 淡紅 顆粒染色過深 染色10min,50%乙醇分色5s 紅包淡紫色 藍色/天藍 微紅 分色稍過度 染色15min,50%乙醇分色5s 深紅包紅色 藍色/天藍 微紅 三種細胞類型可以較好區分 染色15min,95%乙醇分色5s 鮮紅/紫紅 藍色 微紫 三種細胞類型可以較好區分 表3 2

30、5℃不同染色條件下混合染料部分染色效果 染色程序 顆粒著色 細胞核著色 細胞質著色 備注 染色10min,水洗 紅黑/紅 紅褐色 淡紅 染色過深 適量混合染液1:2,染10而n,水洗 紅/淡紫 淡藍色 微紅 染色過淺 1:2,染10而n,水洗 紅/紫紅 藍紫色 淡紫 部分細胞的顆粒將核掩蓋 適量混合染液染色10而n,水洗 紅/紫紅 藍/藍紫 淡紅/淡紫 部分細胞的顆粒將核掩蓋 染色10而n,50%乙醇分色5s 紅/紫紅 藍紫 淡紫

31、 部分細胞的顆粒將核掩蓋 染色15而n,95%乙醇洗55 淡紅/無色 淡紫 微紫 分色過度 參考文獻 [1]周永燦,邢玉娜,馮全英等.魚類血細胞研究進展[J].海南大學學報(自然科學版),2003,21(2):171-176. [2] 周賢君,代應貴,王開功等.低等脊椎動物血細胞研究概況[J].水利漁業,2008,28(2):9-12. [3] 余燕萍,石安靜.貝類血細胞研究進展[J].動物學雜志,1998,(5):40-44. [4] 孫敬鋒,吳信忠.貝類血細胞及其免疫功能研究進展[J].水生生物學報,2006,30(5):601-607. [5]李瓊芬

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