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1、單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,#,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,#,檸檬酸發酵機制,重點：,檸檬酸生物合成途徑；檸檬酸生物合成的代謝調節機制。,難點：,檸檬酸生物合成的代謝調節機制。,1,一、檸檬酸簡介,檸檬酸又名枸櫞酸，學名,-,羥基丙烷三羧酸，是生物體主要代謝產物之一。化學名稱,2-,羥基丙三羧酸，英文文獻俗名,citric acid,，分子式,C,6,H,8,O,7,。無色或白色晶體，無臭，味極酸，易溶于水和乙醇、微溶于乙醚、水溶液呈酸性反應。,第一節 概述,2,食品工業：,酸味劑
2、、增溶劑、抗氧化劑，除腥脫臭劑；,醫藥工業：,化學工業：,美容品、化妝品,二、檸檬酸及其鹽的應用概況,3,三、我國檸檬酸生產現狀,生產狀況：,60,年代開始，生產檸檬酸年總產量居世界第一，出口量一直占國內總產量的,50%,以上。目前，生產廠家近百家，萬噸級以上的有,6,家。主要有,安徽豐原生物化學集團公司,（生產能力為,12.0,萬噸,/,年）、,江蘇無錫羅氏中亞檸檬酸有限公司,（生產能力為,4.0,萬噸,/,年）、,安徽華源生物藥業有限公司,（生產能力為,3.5,萬噸,/,年）等。,存在問題：,出口量增長過快，技術創新相對滯后，加上國際市場競爭激烈，已出現嚴重的供大于求的局面，設備利用率不到
3、,60%,，行業經濟效益呈滑坡態勢。,4,5,第二節 檸檬酸合成途徑與代謝調控,1940,年，,Krebs:TCA,；,1953,年，,Jagnnathan,證實黑曲霉中存在,EMP,途徑所有酶；,1954,年，,Shu,提出葡萄糖,80%,經,EMP,途徑代謝；,1954-1955,年，,Ramakrishman,等發現黑曲霉中存在,TCA,循環。,一、檸檬酸合成途徑的發現,6,二、黑曲霉檸檬酸生物合成途徑,7,黑曲霉利用糖類發酵生成檸檬酸其生物合成途徑是，葡萄糖經,EMP,、,HMP,途徑降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脫羧生成乙酰,CoA,，另一方面經,CO,2,固定化反應生成草酰乙酸，
4、草酰乙酸與乙酰,CoA,縮合生成檸檬酸。,(1),生長期與產酸期都存在,EMP,與,HMP,途徑，前者,EMP:HMP=2:1,，后者,EMP:HMP=4,：,1,(2),黑曲霉檸檬酸產生菌中存在,TCA,循環與乙醛酸循環，在以糖質原料發酵時，當檸檬酸積累時，,TCA,和乙醛酸循環被,阻斷或減弱,。,(3),由于,TCA,和乙醛酸循環被阻斷或減弱，,草酰乙酸,是由丙酮酸（,PYR,）或磷酸烯醇式丙酮酸（,PEP,）羧化生成的。即由兩個,CO,2,固定化反應體系，其中以丙酮酸羧化酶作用下固定化,CO,2,生成草酰乙酸為主。,8,三、檸檬酸生物合成的代謝調節機制,9,1,、磷酸果糖激酶（,PFK,
5、）：,（一）糖酵解及丙酮酸代謝的調節,Mn,2+,濃度對磷酸果糖激酶的影響,Mn,2+,缺乏為何會使,NH,4,+,濃度升高呢,？,當培養基中,Mn,2+,缺乏時，微生物體內積累幾種氨基酸（,GA,、,GLu,、,Arg,、,Oin,等），這些氨基酸的積累，意味著體內蛋白質的合成受阻，而外源蛋白質的分解速度則不受到影響，這樣,NH,4,+,的消耗下降，,NH,4,+,濃度就會升高。,10,2,、丙酮酸羧化酶：,催化生成草酰乙酸。,3,、丙酮酸脫氫酶：,催化生成乙酰,CoA,11,（二）三羧酸循環的調節,1,、檸檬酸合成酶的調節：,檸檬酸合成酶是,TCA,循環第一個酶。但黑曲霉中檸檬酸合成酶沒有
6、調節作用。,2,、順烏頭酸水合酶、異檸檬酸脫氫酶的調節：,順烏頭酸水合酶、,NAD,和,NADP-,異檸檬酸脫氫酶,在檸檬酸產生與不產生時，這,3,種酶均存在，而當銅離子,0.3mg/L,，鐵離子,2mg/L,和,pH2.0,情況下，這,3,種酶均不出現活力，發酵中檸檬酸正是在這個,pH,條件下積累的。,順烏頭酸水合酶,是催化檸檬酸,順烏頭酸,異檸檬酸正逆反應的酶，研究表明，黑曲霉中有一種單純的位于線粒體上的順烏頭酸水合酶，它在催化時能建立下面的平衡：檸檬酸,:,順烏頭酸,:,異檸檬酸,90:3:7,。,12,3,、,-,酮戊二酸脫氫酶的調節,在黑曲霉檸檬酸產生菌中，,TCA,循環的一個顯著特
7、點是，,-,酮戊二酸脫氫酶的合成受葡萄糖和銨離子的阻遏。因此當以葡萄糖為碳源時，在檸檬酸生成期，菌體內不存在,-,酮戊二酸脫氫酶或活力很低。,-,酮戊二酸脫氫酶催化的反應是,TCA,循環中唯一不可逆反應，一旦,-,酮戊二酸脫氫酶喪失，就會引起：,TCA,循環中的蘋果酸、富馬酸、琥珀酸是由草酰乙酸逆,TCA,循環生成，使,TCA,循環成,“,馬蹄形,”,。,-,酮戊二酸又抑制異檸檬酸脫氫酶的活性。,13,(,三,),氧對檸檬酸積累的調節,乙酰,CoA,和草酰乙酸結合生成檸檬酸過程中要引進一個氧原子，因此氧也可以看作為檸檬酸生物合成底物。它對檸檬酸發酵的作用為：,(1),氧是發酵過程生成的,NAD
8、H2,重新氧化的氫受體。,(2),近來的研究發現，黑曲霉中除了具有一條標準呼吸鏈以外，還有一條側系呼吸鏈。,當缺氧時，只要很短時間中斷供氧，就會導致此側系呼吸鏈的不可逆失活，而導致檸檬酸產酸急劇下降。,14,（四）乙醛酸循環與醋酸發酵檸檬酸,乙醇,乙酸,3,醋酸,1,檸檬酸,生成的檸檬酸一半轉化為異檸檬酸,酵母,N,源耗盡后開始烷烴發酵，低濃度,AMP,抑制,NAD-,異檸檬酸脫氫酶的活性，檸檬酸大量合成并積累。此時順烏頭酸水合酶催化反應平衡為：檸檬酸：異檸檬酸：順烏頭酸,=90,：,7,：,3,。細胞質中積累大量異檸檬酸。,15,Mn,2+,缺乏抑制蛋白合成,NH,4,+,，有一條呼吸活動強
9、的不產生,ATP,的側呼吸鏈：,解除磷酸果糖激酶的代謝調節,，,促進,EMP,途徑暢通。,丙酮酸羧化酶是組成型酶，不被調節控制。丙酮酸氧化脫羧生成乙酰,CoA,和,CO,2,的固定兩個反應的平衡，以及檸檬酸合成酶不被調節，增強了合成檸檬酸的能力。,小結：,順烏頭酸水合酶在催化時建立了以下平衡：,檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸,=90,：,3,：,7,同時控制,Fe,2+,含量時，順烏頭酸酶活力降低，使檸檬酸積累。,隨著檸檬酸積累，,pH,降低到一定程度時，使順烏頭酸酶和異檸檬酸脫氫酶失活，更有利于檸檬酸的積累。,16,（五）檸檬酸發酵的產率,1,、無,CO,2,固定反應的產率,合成,1,分子檸檬酸
10、需要,3,分子乙酰輔酶,A,，也就是需要,1.5,分子的葡萄糖。,理論產率為：,192/(1801.5)=71.1%,17,2,、通過,CO,2,固定反應提供,C,4,二羧酸,18,四、檸檬酸發酵過程的控制要點,（,1,）控制,Mn,2+,、,NH,4,+,濃度，解除檸檬酸對,PFK,的抑制，使,EMP,暢通無阻。,（,3,）控制培養基中的,Fe,2+,的濃度，使順烏頭酸水合酶失活。,（,2,）控制溶氧，防止側系呼吸鏈失活。,19,五、檸檬酸產生菌育種的傳統方法：,1.,透明圈大的菌株,平板：,10%,甘薯,+2%,的瓊脂,+0.5%CaCO,3,誘變后，涂布，透明圈大的則好,2.,顯色圈大小
11、,平板：麥汁培養基,+pH,值指示劑 誘變后，,33,培養,3,天，透明圈大的則好。,20,3.,不分解檸檬酸的菌株,不利用檸檬酸為碳源的菌株，說明其,TCA,循環中檸檬酸后續酶的活性較低，或者喪失，這有利于積累檸檬酸。方法：以檸檬酸為唯一碳源的培養基上生長不好的突變株。,4.,選育不長孢子、少長孢子、遲長孢子的菌株,在培養基中如果菌株能夠大量合成積累檸檬酸，自然會使,TCA,循環中的中間產物濃度降低，這樣不利于孢子的形成。,（為何？中間產物少，,C,架少，不利于合成代謝,）,21,思考題,1.,檸檬酸發酵過程中有哪幾個控制要點，如何控制？,2.,說明檸檬酸發酵過程中氧的重要性。,3.,簡述二氧化碳固定反應對提高檸檬酸產率的意義。,22,
檸檬酸發酵機制
