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1、,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣
2、式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10
3、/10,*,單擊此處編輯母版標題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級,第三級,第四級,第五級,2021/10/10,*,細胞培養中污染物的預防與清除,中科院上海生化細胞所,2016，Jan，22-24,2021/10/10,1,培訓班目的：,提高各生物資源保藏庫在資源保藏、評價方面的科技創新與服務能力。,資源保藏、評價,創新能力,服務能力,（科學院對我們的要求）,2021/10/10,2,十八大明確提出要“實施創新驅動發展戰略，強調科技創新是提高社會生產力和綜合國力的戰略支撐，必須擺在國家發展全局的核心位置”。,我國科技服務業已經具備一定的發展基礎，但是與英、美等發達國家相比，我國的科技服務
4、業產值及其占,GDP,比重較低，,2011,年度實現科技服務增加值不足,7000,億元，占,GDP,比重約為,1.4%,。,2014,年,10,月，國務院印發,關于加快科技服務業發展的若干意見,（國發,201449,號），這是國務院,首次,對,科技服務業,發展作出的全面部署。,用創新驅動科技服務業的發展,（國家對我們的要求）,2021/10/10,3,細胞資源為生物醫藥基礎研究和產業發展提供支撐和保障,細胞資源保藏和技術研發,人類遺傳資源庫,基礎研究實驗細胞庫,國家發展和安全戰略,2021/10/10,4,一，,細胞系是重要的遺傳資源。細胞庫的功能包括資源,保藏,能力、資源,利用,能力和資源,
5、開發,能力。這三方面的提升是建設一流細胞保藏單位的關鍵抓手，也是推動細胞庫向科技服務業,轉移重心,的必經之路。,二，,保證細胞株不受污染是細胞庫保藏能力的關鍵性標志，也是其他能力提升的基礎。,2021/10/10,5,一，,細胞系是重要的遺傳資源。由細胞庫（,Cell Bank,）負責保存細胞系。,細胞庫,技術咨詢,對外供應,鑒定檢測,文檔管理,細胞培養,質量控制,保藏、評價,開放、共享,技術服務,培訓科普,2021/10/10,6,一，,細胞系是重要的遺傳資源。負責保存細胞系的細胞庫應當開發、承擔更多的功能，提升服務科技、服務社會的能力，產生更高的服務業產值。,細胞庫,技術咨詢,對外供應,鑒
6、定檢測,文檔管理,細胞培養,質量控制,保藏、評價,開放、共享,技術服務,培訓科普,拓寬收集渠道,提升保藏特色,瞄準科技發展前沿提升利用開發水平,2021/10/10,7,一，,細胞系是重要的遺傳資源。保存細胞系的細胞庫其功能包括資源保藏能力、資源利用能力和資源開發能力。這三方面的提升是建設一流細胞保藏單位的關鍵抓手。,中科院細胞庫,堅持國際接軌的細胞保藏技術水平，積極吸引國內有知識產權的細胞系進入細胞庫保藏，逐步形成自己的特色。,堅持用戶至上的服務態度，全方位為用戶著想為用戶服務，積極推動庫內細胞資源的利用。,密切關注國際細胞生物學發展前沿，主動與醫院等單位合作，拓寬細胞資源的種類，為我國細胞
7、生物學的進一步發展做好準備。,我們的目標,2021/10/10,8,二，污染是細胞培養的大敵。保證細胞株不受污染是細胞庫保藏能力的關鍵性標志，也是其他能力提升的基礎,1,，細菌污染,2,，真菌污染,3,，支原體污染,4,，內毒素污染,5,，細胞間交叉污染,2021/10/10,9,1,，細菌污染。,實驗室中因操作不慎而引起的污染，即使在細胞培養液中加入了預防劑量的抗菌素也會產生。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌，以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養細胞受細菌污染后，會出現培養液變混濁，,pH,改變。也有的培養液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發現菌體才知污染。
8、污染后細胞發生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成實驗失敗和細胞株,(,系,),丟失。,2021/10/10,10,2,，真菌污染,在細胞培養過程中較為常見，尤其在南方霉雨季節進行細胞培養更易產生。最常見的真菌有：煙曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌等。培養細胞受真菌污染后，可見培養液中漂浮著白色或淺黃色小點，培養液一般不發生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。,2021/10/10,11,3,，支原體污染,3.1,，支原體污染是目前實驗室中最為常見的污染細胞的原核生物。,
9、因支原體屬于直徑介于,0.2,左右的最小原核生物，形態易變，故極易通過濾膜而逃過培養液的過濾除菌步驟。在細胞培養液中，支原體可達到,10,7,-10,8,CFU/mL,（,CFU=Colony Forming Unit,，支原體濃度測量單位）而不使培養液混濁及影響細胞生長。多種支原體對細胞不產生任何病變效應，使得細胞污染不易被察覺。據報道，目前世界上有,30-50%,的細胞株已受支原體污染。但是支原體對干細胞培養的影響甚大，胚胎干細胞受支原體污染形態、生長速度等均出現改變。,在細胞培養過程中如果在顯微鏡下發現破碎的細胞很多，需要頻繁換液才能維持傳代培養的時候，即應懷疑支原體污染。,2021/1
10、0/10,12,由于多數細胞受支原體污染后無明顯變化或略有變化，若不及時處理，將產生交叉污染。另外，支原體會改變宿主細胞的結構和功能等一系列特征，因此盡管很多受支原體污染的細胞其形態看不出變化，但對其進行進一步分子生物學分析時，其實驗結果會不準確。為此建議各實驗室定期對細胞進行支原體檢查。,可污染細胞的支原體種類較多，主要有,Mycoplasma orale,M.hyorhinis,M.arginini,和,Acholeplasma laidlawii,。目前已發現的支原體超過,100,種，這就是單一的檢測方法有時會失敗的原因之一。我們建議至少選擇,2,種方法來檢測支原體。,2021/10/1
11、0,13,3.2,，常用支原體檢測方法,3.2.1,，肉湯培養基檢測法。醫藥行業規定使用。,3.2.2,，間接染色法檢測支原體,用待檢測的細胞培液培養,Vero,細胞，然后用顯微鏡觀察是否有支原體感染。,Vero,細胞來源于正常的成年非洲綠猴腎組織，由,Y.Yasumura,和,Y.Kawakita,于,1962,年在日本,Chiba,大學分離得到。,Vero,細胞是非整倍體，可在培養液中無限生長，常用來生產疫苗，檢測支原體和細菌外毒素等。細胞培養液中的支原體可用,Hoechst33258,或,DAPI,染色后觀察到。由于支原體含有,DNA,，染色后在細胞表面，培養基中及培養皿表面呈現出熒光小
12、點。,2021/10/10,14,Vero,細胞,DAPI,染色熒光照片,(400),。,A,，感染支原體的,Vero,細胞。藍色卵圓形熒光物質為,Vero,細胞核，其周圍藍色熒光小點為支原體,(,箭頭,),；,B,，未感染支原體的陰性對照,Vero,細胞；,C,，加入待檢培養液的,Vero,細胞,(,未感染支原體,),。,A,B,C,間接染色法檢測支原體,2021/10/10,15,3.2.2,，,PCR,法檢測支原體,許多支原體檢測方法不僅用時長而且復雜，有的方法僅限于檢測有限種類的支原體。,PCR,檢測法靈敏度高，特異性強，只用一天時間即可快速檢測細胞培養液中的支原體，是一種檢測支原體的
13、有效手段。中科院干細胞庫選擇支原體,16S rDNA,序列為靶序列設計引物，同時做對照組實驗和干擾實驗以避免假陽性或假陰性結果，取得了很好的效果。,2021/10/10,16,PCR,法支原體檢測電泳圖。,+,：陽性對照；,-,：陰性對照；,1,：送檢樣品,1,（感染支原體）；,2,：送檢樣品,2,（未感染支原體）；,3,：樣品,1,的干擾實驗；,4,：樣品,2,的干擾實驗。若在,270bp,處有條帶，檢測結果為陽性。陽性對照及干擾實驗,PCR,產物在,270bp,處有一條帶，陰性對照無條帶，證明本次實驗準確可靠。,600bp,400bp,500bp,200bp,300bp,100bp,Mar
14、ker +-1 2 3 4,PCR,法檢測支原體,2021/10/10,17,預防：,1.,支原體噴霧（品牌：,Biochrom),：噴于操作臺和培養箱,2.Plasmocin prophylactic,（品牌：,InvivoGen,）：作用濃度為,5g/ml,作用于常規的細胞培養基（,500 x,稀釋）,去除：,Plasmocin treatment,（品牌：,InvivoGen,）：作用濃度為,25g/ml,，作用于感染的培養細胞基兩周（,1000 x,稀釋）。,3.3,，支原體污染的預防和去除,2021/10/10,18,4.1,，細菌內毒素對培養物的危害：,實驗證明，細菌內毒素對培養細
15、胞（尤其是,ES,細胞）的生長及活性具有明顯的抑制作用,且該作用具有一定的時間、劑量依賴性。,4.2,，細胞培養中內毒素的來源：,細胞培養基中的主要天然成份,-,牛血清包括胎牛血清和新生牛血清是內毒素的潛在來源。我國,2000,年版,中國生物制品主要原輔料質控標準,中對牛血清提出比較嚴格的標準要求。包括蛋白質含量，細菌、真菌、支原體、牛病毒、大腸桿菌噬菌體、細菌內毒素，支持細胞增殖檢查等等。對于胚胎干細胞培養，,LIF,和,bFGF,是細菌內毒素的另一個潛在來源。,4,，內毒素污染,2021/10/10,19,4.3,，細胞培養中內毒素的監控：,為排除血清、,LIF,和,bFGF,中內毒素的污
16、染，細菌內毒素檢測是非常重要的。中國科學院干細胞庫只使用細菌內毒素小于,1EU/ml,的血清、,LIF,和,bFGF,等各種生長因子。,4.4,，內毒素監控是細胞用于臨床治療所必須的。,目前各類臨床級干細胞尚無統一的國際、國內標準，這是胚胎干細胞進入實際應用階段的最大障礙之一，也是細胞庫水平的一個重要標志。但是在制藥工業中內毒素是必須去除的。因此，中國科學院干細胞庫強調高標準嚴要求，把內毒素監控作為細胞培養的常規標準。,2021/10/10,20,鱟試劑凝膠半定量法檢測（參考,2010,年版,中國藥典,）,4.5,，內毒素檢測方法,鱟試劑：鱟科動物東方鱟的血液變形細胞溶解物的無菌冷凍干燥品，含有能被微量細菌內毒素激活的凝固酶原（,Proclotting enzyme,）和凝固蛋白原（,Coagulogen,）。在適宜的條件下（溫度，,pH,值及無干擾物質），細菌內毒素激活鱟試劑中的凝固酶原，使鱟試劑產生凝集反應形成凝膠。凝膠法鱟試劑是根據反應所形成凝膠的程度來檢測樣品內內毒素的含量。,2021/10/10,21,5,，細胞間交叉污染,Hela,細胞是第一株源細胞系。,1952,年建系以
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